Linee guida

LINEE GUIDA PER LO SCREENING DEI PAZIENTI TROMBOFILICI

TROMBOSI VENOSA

La migliore comprensione dei meccanismi di regolazione dell'emostasi e le indagini di laboratorio eseguite su migliaia di pazienti trombofilici, hanno consentito di stabilire la relazione fra parametri emostatici e trombosi venosa (1, 2). I deficit congeniti dei meccanismi degli anticoagulanti naturali predispongono il soggetto portatore ad un aumentato rischio di trombosi venosa. L'iperprotrombinemia sostenuta da una mutazione nel gene della protrombina è associata ad aumentato rischio trombotico. Un altro fattore di rischio acquisito per trombosi venosa (ma anche arteriosa) è la presenza di anticorpi antifosfolipidi. L'iperomocisteinemia moderata, in passato nota come fattore di rischio di trombosi arteriosa è oggi riconosciuta anche come fattore di rischio di trombosi venosa.
La ricerca mirata dei soli deficit congeniti dei sistemi degli anticoagulanti naturali su soggetti con precedente storia trombotica, particolarmente se in età giovanile (meno di 50 anni) e dopo esclusione dei fattori di rischio acquisiti di più comune evenienza (ad es. neoplasie), potrebbe spiegare la causa della trombosi in più della metà dei soggetti. Lo screening esteso ai membri della famiglia del probando, potrebbe inoltre, identificare quei soggetti ancora asintomatici, ma portatori del difetto, che più di altri potrebbero giovarsi delle misure profilattiche in situazioni a rischio (interventi chirurgici, gravidanze, contraccettivi orali, ecc.). È, quindi, del tutto evidente come una strategia concertata fra il clinico, che seleziona i pazienti più idonei a giovarsi dello screening e lo specialista di laboratorio di emostasi che allestisce ed esegue i test più appropriati, sia il requisito essenziale per la razionalizzazione della spesa e l'uso appropriato delle scarse risorse oramai disponibili.

Difetti congeniti dell'emostasi associati a trombosi venosa

Sono tutti difetti che si trasmettono con tratto autosomico dominante.
Anticoagulanti naturali. I soggetti con carenza congenita anche di uno solo degli anticoagulanti naturali, anche se a livelli del 50% della norma, sviluppano con maggiore frequenza trombosi venose; molto rare le trombosi arteriose. I difetti congeniti di antitrombina, proteina C e proteina S sono complessivamente responsabili del 15-20% degli episodi trombotici in soggetti giovani (meno di 50 anni). A causa della incompleta penetranza dei difetti, non tutti gli individui carenti sviluppano la trombosi. La comparsa dei sintomi è correlata con l'età. La probabilità è bassa al di sotto dei 20 anni e diventa significativamente elevata al di sopra dei 50. Circa la metà dei pazienti sviluppano la trombosi spontaneamente, la restante parte in concomitanza di fattori scatenanti (gravidanza, traumi, interventi chirurgici, o uso di contraccettivi orali). Per quanto riguarda l'antitrombina, le varianti che si esprimono con un difetto di legame per l'eparina presentano, rispetto alle varianti con difetto di legame per le proteasi seriniche, una minore incidenza di eventi trombotici. Queste osservazioni trovano riscontro nel fatto che le uniche famiglie finora descritte con membri affetti da carenza omozigote presentano un difetto di legame per l'eparina. È probabile che la carenza omozigote nelle altre varianti a maggior rischio trombotico non sia compatibile con la vita. Per quanto riguarda la proteina C e la proteina S sono state descritte anche carenze omozigoti, con livelli estremamente ridotti di attività funzionale (anche meno del 5%) e con sintomi trombotici che possono comparire in maniera drammatica subito dopo la nascita ("purpura fulminans") e avere anche decorso fatale.

Resistenza alla proteina C attivata.

Se al plasma umano normale si aggiungono concentrazioni crescenti di proteina C attivata, si assiste ad un prolungamento proporzionale del tempo di coagulazione (ad esempio il tempo di tromboplastina parziale attivato, APTT), come conseguenza dell'inattivazione dei Fattori Va e VIIIa. Esistono soggetti il cui tempo di coagulazione, dopo aggiunta in vitro di proteina C attivata, non si prolunga adeguatamente (3). Responsabile di tale anomalia, denominata resistenza alla proteina C attivata, è nella stragrande maggioranza dei casi (più del 90%) una mutazione nel gene del Fattore V (Fattore V Leiden), che comporta una sostituzione amminoacidica nella proteina matura (4). Tale mutazione coinvolge uno dei siti dove il Fattore Va viene inattivato dalla proteina C attivata. Il Fattore Va mutato mantiene inalterata la propria attività procoagulante, ma resiste alla inattivazione, determinando nei soggetti portatori uno stato di ipercoagulabilità con aumentato rischio di trombosi venosa (5, 6). La resistenza alla proteina C attivata, sostenuta dalla mutazione del Fattore V Leiden, rappresenta la causa più frequente di trombosi eredofamiliare finora identificata. Il difetto ha una prevalenza nella popolazione trombofilica del 20-60% (5, 7) a seconda della selezione della casistica, ed è presente nella popolazione normale con una prevalenza variabilie dal 3 al 15% (8). Si può presentare anche allo stato omozigote e, considerata la sua alta prevalenza nella popolazione, si associa con una certa frequenza ad altre carenze congenite (antitrombina, proteina C, proteina S), o difetti acquisiti (anticorpi antifosfolipidi, iperomocisteinemia, ecc.), aumentando così il rischio di trombosi nei soggetti portatori (9-12).

 

Mutazione 20210A della protrombina.

Recentememente è stata identificata un'ulteriore mutazione protrombotica a carico del gene per la protrombina (20210A), che si esprime fenotipicamente con un aumento dell'attività della protrombina nel plasma (13). La prevalenza del difetto nella popolazione trombofilica è del 10-18% a seconda della selezione della casistica e del 1% nella popolazione generale. Apparentemente la mutazione da sola conferisce un rischio relativo abbastanza modesto, ma l'associazione con altri difetti potrebbe incrementarlo.

 

Quali metodi per identificare i difetti congeniti

I difetti congeniti (antitrombina, proteina C/S, Fattore V Leiden e mutazione della protrombina) potrebbero essere identificati mediante l'analisi del DNA. Essa sarebbe preferibile rispetto alla misura sul plasma perché darebbe una risposta univoca. In pratica ciò è fattibile solo in alcuni casi particolari (ad es. Fattore V Leiden e mutazione della protrombina), dove si conosce con certezza la localizzazione della mutazione. In tutti gli altri casi, ci si deve accontentare di documentare la manifestazione fenotipica studiando il plasma. Là dove è possibile, lo screening di laboratorio deve essere eseguito utilizzando esclusivamente metodi funzionali (1, 14). Esistono, infatti, numerose carenze congenite sostenute dalla presenza di molecole disfunzionali degli anticoagulanti naturali. In questi casi la concentrazione antigenica della proteina è normale, ed è solo la sua attività funzionale che è ridotta.
Per l'antitrombina, i metodi funzionali che misurano l'attività inibitoria esercitata nei riguardi della trombina o del Fattore Xa in presenza di eparina, sono idonei allo screening di laboratorio.
Per la proteina C numerosi sono i metodi funzionali finora descritti ed esistono kit commerciali di semplice esecuzione. Essi si basano sulla misura dell'attività anticoagulante della proteina C attivata nei riguardi dei suoi substrati naturali (Fattore VIIIa e Va), o sull'attività amidolitica che la proteina C attivata esercita nei riguardi di piccoli substrati artificiali (substrati cromogenici). In generale le due attività (anticoagulante e amidolitica) sono fra loro in accordo, ma sono stati descritti pazienti con attività discrepanti. Per lo screening del paziente trombofilico, si consiglia l'uso dei metodi amidolitici, perchè di più semplice esecuzione e meno soggetti ad interferenze.
La proteina S circola nel plasma sotto due forme: libera per il 40% e legata ad una proteina regolatrice del complemento, C4b-binding protein (C4bBP) per il 60%. Le due forme sono fra loro in equilibrio e solo quella libera è funzionalmente attiva. In conseguenza di questa peculiare distribuzione, la carenza di proteina S può presentarsi almeno sotto tre forme distinte. Deficit totale della proteina, deficit della sola forma libera e presenza di proteina S disfunzionale. Tutto questo complica la diagnosi di laboratorio. Il metodo funzionale, esplora le capacità cofattoriali della proteina S nei riguardi della proteina C attivata e sarebbe quindi da solo in grado di identificare tutte le forme di carenza. Tuttavia, esso è influenzato dalla presenza della mutazione del Fattore V Leiden e questo ne limita l'uso. Allo stato attuale, è consigliabile basare la diagnosi sulla misura antigenica della proteina S libera, che si può effettuare mediante anticorpi monoclonali che riconoscono la sola forma libera, o mediante anticorpi policlonali, dopo aver eliminato dal plasma la forma legata mediante precipitazione selettiva con polietilenglicole (PEG).
Per la resistenza alla proteina C attivata la diagnosi di laboratorio si esegue con test funzionali su plasma che valutano l'entità del prolungamento del tempo di coagulazione dopo aggiunta di proteina C attivata. La sensibilità di questi metodi nello svelare il difetto sostenuto dalla mutazione del Fattore V Leiden, è vicina al 100%, non cosi'la loro specificità, che si avvicina al 100% solo quando il plasma del paziente viene diluito in plasma carente di Fattore V prima dell'esecuzione del test (15). All'identificazione di un soggetto resistente è sempre buona norma far seguire la conferma con il test genetico. L'alternativa di eseguire l'analisi genetica direttamente nella fase di screening, sebbene tecnicamente praticabile, comporta costi relativamente elevati e non sempre giustificabili.
La presenza della mutazione nel gene della protrombina si associa ad aumentati livelli di protrombina nel plasma, tuttavia a causa della notevole sovvrapposizione di valori fra portatori e non portatori, la sola misura dei livelli plasmatici della protrombina non è idonea ad identificare i soggetti portatori della mutazione. Attualmente l'analisi del DNA sembra l'unica via praticabile.

 

Sindrome da Anticorpi Antifosfolipidi

Questa sindrome è sostenuta dalla presenza nel plasma di anticorpi diretti contro i fosfolipidi anionici, o contro i complessi di alcune proteine (proteina C, proteina S, protrombina, beta2-glicoproteina I) e i fosfolipidi (16). In un certo numero di pazienti la presenza degli anticorpi è associata all'insorgenza di sintomi trombotici venosi e/o arteriosi, aborti ripetuti e piastrinopenia. La diagnosi di laboratorio può essere effettuata mediante metodi diretti che evidenziano la presenza degli anticorpi in fase solida, usando come antigene catturante la cardiolipina (ricerca degli anticorpi anticardiolipina) e mediante metodi indiretti che sfruttano l'interferenza che gli anticorpi hanno sui test classici della coagulazione dipendenti dai fosfolipidi (ricerca dell'anticoagulante lupico, LA). A causa della impossibilità di identificare con un singolo test le diverse classi di LA, i comitati di standardizzazione, hanno stabilito una strategia diagnostica basata su tre criteri principali (17). Il primo criterio impone che uno (o più) dei test fosfolipidi-dipendenti sia prolungato oltre i limiti della norma (test di screening). Bisogna poi dimostrare che il prolungamento sia effettivamente dovuto alla presenza di un anticoagulante circolante (test della miscela per il secondo criterio). Il terzo criterio impone di provare che l'inibitore sia diretto contro i fosfolipidi,(test di conferma). In teoria, qualsiasi test fosfolipide-dipendente, che esplori globalmente o in parte la cascata coagulatoria e sia eseguito su plasma filtrato, sarebbe idoneo a svelare la presenza del LA. In pratica, il test più usato per ragioni storiche e di comodità è l'APTT, che non è però idoneo allo screening, a causa della sua scarsa sensibilità. Test più sensibili sono il tempo di coagulazione al caolino (KCT) e il test al veleno di vipera Russell diluito (dRVVT). Il test della miscela si esegue con qualunque dei test di screening precedentemente esaminati e consiste nella ripetizione del test su una miscela plasma paziente/plasma normale. La persistenza del prolungamento del tempo di coagulazione eseguito sulla miscela, suggerisce la presenza di un anticoagulante circolante.
I test di conferma sono per lo più basati sull'incremento, o la diminuzione della concentrazione dei fosfolipidi, o sull'uso di fosfolipidi a conformazione particolare. Il tempo di coagulazione di un test fosfolipide-dipendente, prolungato per la presenza del LA, si accorcia sensibilmente fino a correggere quasi completamente il difetto, se ripetuto aumentando la concentrazione dei fosfolipidi. Al contrario, il test si prolungherà se viene diminuita la concentrazione dei fosfolipidi. Esistono numerosi test di conferma, ed esistono diverse fonti possibili di fosfolipidi. Fra i test di conferma più usati ricordiamo l'APTT con aggiunta di lisato piastrinico quale fonte di fosfolipidi. Il test di conferma può anche essere eseguito con il dRVVT con aggiunta di fosfolipidi concentrati. Anche il tempo di protrombina (PT), se eseguito con tromboplastina opportunamente diluita, si può considerare nell'armamentario del laboratorio per la diagnostica del LA. L'uso di silice micronizzata in combinazione con fosfolpidi a bassa concentrazione può essere un buon sostituto del KCT nella procedura di screening. La ripetizione del test con fosfolipidi a più alta concentrazione consente di disporre di un test di conferma facilmente automatizzabile e di semplice esecuzione. Infine, fra le procedure di conferma di più recente introduzione bisogna ricordare l'APTT eseguito mediante fosfolipidi a conformazione esagonale. Quest'ultima conformazione renderebbe i fosfolipidi più disponibili a legare il LA che verrebbe, pertanto, riconosciuto con una maggiore sensibilità e specificità. Tutte le procedure di conferma non hanno risolto definitivamente il problema della specificità. False positività in plasmi con inibitori diretti contro il Fattore V o VIII sono purtroppo di frequente riscontro con qualunque delle procedure sopra ricordate. La storia clinica del paziente, che sarà evidentemente di tipo emorragico in caso di inibitore diretto contro il Fattore V o VIII, aiuterà a risolvere eventuali dubbi. La presenza di anticorpi anticardiolipina, rivelati in fase solida, non deve essere considerato un criterio di conferma per il LA. Infatti, non è infrequente che le due positività non coesistano nello stesso paziente.

 

Iperomocisteinemia

L'omocisteina è un prodotto del catabolismo degli amminoacidi solforati (metionina) (18). Essa è presente nel plasma sotto varie forme che possono circolare libere o legate alle proteine;
raggiungono una concentrazione nel normale di 5-15 umol/L e vengono globalmente denominate omocisteina totale. Esistono situazioni congenite o acquisite che portano all'accumulo nel plasma di omocisteina. Fra queste la più importante è la carenza congenita di cistationina-beta-sintetasi, che allo stato omozigote può portare all'accumulo di livelli del metabolita superiori a 100 umol/L. Il difetto allo stato omozigote ha una prevalenza nella popolazione di circa 1:200mila-1:300mila e determina nei soggetti portatori la sindrome classica denominata omocistinuria, caratterizzata, fra l'altro, dall'insorgenza precoce di malattie cardiovascolari e tromboemboliche.
Forme meno gravi di iperomocisteinemia possono essere di frequente riscontro in soggetti affetti da un difetto congenito della metilen-tetra-idro-folato-reduttasi (MTHFR), che rappresenta un'altra via metabolica dell'omocisteina. Le forme più frequenti di iperomocisteinemia acquisita sono per lo più secondarie a deficit di folati e vitamina B12. Studi caso-controllo hanno dimostrato come anche l'iperomocisteinemia moderata possa essere causa di insorgenza di trombosi arteriosa (ictus, infarto del miocardio e trombosi arteriose periferiche). Recentemente è stato dimostrato come l'iperomocisteinemia moderata sia associata con una certa frequenza anche all'insorgenza di trombosi venosa. La diagnosi di laboratorio dell'iperomocisteinemia è basata sulla misura della concentrazione plasmatica totale del metabolita mediante cromatografia ad alta pressione. La diagnosi non comporta particolari problemi nei soggetti omozigoti, mentre negli eterozigoti la misura dei livelli di metabolita 4 ore dopo un carico orale di metionina può migliorare la capacità diagnostica del test.